2016

Развитые в лаборатории  методики низкочастотного комбинационного рассеяния света, наблюдения КР-линий конформационно-чувствительных связей и генерации второй гармоники позволяют идентифицировать и изучать явления самоорганизации на нанометровом масштабе  в различных материалах, включая стеклующиеся жидкости, фосфолипидные мембраны, ковалентные стекла, сегнетоэлектрические кристаллы и керамики. В частности нам удалось показать, что можно создать релаксоры без химического беспорядка, определить  температуру образования нанометровых структур в жидкостях, изучить статистику конформационных состояний ацильных хвостов фосфолипидов и исследовать динамику замерзания биологических клеток.

Основные результаты

1. Создан стенд для исследования гиперкомбинационного  и гиперрэлеевского рассеяния в сегнетоэлектрических композициях  и стеклующихся жидкостях. В качестве спектрометра использовался третий монохроматор спектрометра TriVista 777 cдифракционной решеткой на 900 шт/мм, возбуждающим лазером служил импульсный лазер с длиной волны 1064 нм, длиной импульса 0.6 нс, частотой повторения 1 кГц. Средняя мощность лазера составляла около 80 мВт, что соответствует пиковой мощности около 100 кВт. В качестве тестового образца использовалось кварцевое стекло, на котором был сделан ряд предыдущих работ, использующих возбуждение импульсами в несколько десятков наносекунд. В геометрии рассеяния под прямым углом никакого сигнала обнаружено не было, и основные эксперименты были проведены для геометрии назад, которая более удобна для юстировки в этом типа экспериментов (уменьшается роль ошибки из-за «человеческого фактора»). Фокусирующая (и одновременно собирающая в этой геометрии) линза имела фокусное расстояние 75 мм. Согласно обзору V.N. Denisovetal, PhysicsReports, 1987 величина фокуса этой линзы не имеет значения, если вся перетяжка при фокусировке попадает в щель спектрометра. Сами авторы использовали значения фокусов 30-100 мм для рассеяния под прямым углом и более 100 мм для рассеяния вперед (для измерения поляритонов) без заметного изменения сигнала гиперкомбинационного рассеяниия. В работе B. HehlenetalPhys.Rev.Lett. 2000 для рассеяния под прямым углом сигнал гиперрэлеевского рассеяния от кварцевого стекла составлял 5000 отсчетов за 5 минут (100 нс лазерный импульс, 14 Вт пиковая мощность, фокусировка линзой с F = 18 мм, согласно их рис. 2 интенсивность рассеяния назад по порядку величины такая же). Однако для нашей субнаносекундной системы гиперрэлеевский сигнал от кварцевого стекла и стеклующихся жидкостей не превышал 10 отсчетов за 5 минут. Нами сделано предположение, что различие наших результатов с предыдущими связано с тем, что использованные в предыдущих работах Q-switched лазеры находились в режимах со спонтанной пикосекундной модуляцией, повышающей пиковую мощность по сравнению с заявленной.

На примере кристалла в параэлектрической фазе мы  показали, что центральный пик в режиме гиперрэлеевского рассеяния может быть надежно зафиксирован в созданной установке.

2.   Проверена гипотеза о том, что время релаксации при температуре перехода от аррениусовского к неаррениусовоскому поведению стеклующихся жидкостей одинаково для различных веществ. Для этой цели были изучены спектры рассеяния Мандельштама-Бриллюэна следующих веществ: дибутилфталат, глицерин, орто-терфенил, пропилен карбонат, альфа-пиколин, салол, толуол, о-толуидин. Спектры были изучены в широком температурном диапазоне. В этих спектрах проявляется интенсивный пик альфа-релаксации, когда время альфа-релаксации находится в диапазоне от 1 до 20 пс. Из подгонки этого пика контуром Коль-Давидсона  определены температурные зависимости времени альфа-релаксации τ_α (Т) для исследованных стеклующихся жидкостей. Из деривативного анализа зависимостей τ_α (Т) определены температуры перехода от аррениусовского к неаррениусовскому поведению стеклующихся жидкостей T_A, которые составили: 257 К (толуол), 403 К (салол), 250 К (пиколин), 298 К (пропилен карбонат), 408 К (орто-терфенил), 366 К (глицерин), 405 К (дибутилфталат) и 205 К (этанол). На рис. 1 показаны спектры рассеяния Мандельштама-Бриллюэна этих веществ на температуре T_A(кроме этанола, у которого пик альфа-релаксации имеет низкую интенсивность и находится на 4 ГГц при T_A), в спектральной области, где доминирует пик альфа-релаксации.

Рис. 1. Спектр рассеяния Мандельштама-Бриллюэна в области пика альфа-релаксации при T = T_A, для семи стеклующихся жидкостей.

Из Рис. 1 видно, что для различных стеклующихся веществ положение пика варьируется от 4 ГГц до ~ 24 ГГц (соответствующее время релаксации от 40 до 6.6 пс). Можно заключить, что хотя время релаксации τ_α (Т = Т_А)  одного порядка для различных веществ, есть систематическая тенденция к увеличению положения максимума (укорочение времени релаксации) с ростом индекса фрагильности стеклующейся жидкости. Полученный результат находится в качественном согласии с недавним анализом, проведенным в работе V.N. Novikov, Chem.Phys.Lett. для модельных предсказаний перехода от аррениусовского к неаррениусовскому поведению.

Различия в значении времени релаксации при T_A в совокупности с примерно одинаковым значением спектрального положения максимума микроскопического пика означает существенное различие во влиянии альфа-релаксации на затухание колебательных мод, составляющих микроскопический пик. Таким образом, гипотеза о том, что температура T_A универсальным образом соответствует передемпфированию микроскопического пика не подтвердилась.

3. Определено влияние криопротектора глицерина на кинетику фотовыцветания линий цитохрома в замораживаемых дрожжевых клетках. Получено, что использование  криопротекторного раствора (10 % водный раствор глицерина) изменяет кинетику фотовыцветания, которая отражает дыхательную активность клеток. На рис. 2 показана температурная зависимость времени фотовыцветания резонансных линий цитохрома в дрожжевых клетках от температуры. Видно, что выше температуры кристаллизации раствора данные для клеток в физиологическом растворе и клеток в водном растворе глицерина совпадают. Ниже температуры образования льда данные существенно различаются – скорость фотовыцветания в 3-4 раза выше в случае раствора с криопротектором. Этот эффект мы связываем с различием в доступности кислорода для двух вариантов растворов: при замораживании физиологического раствора образуются замкнутые полости, в которых находятся клетки, и, соответственно, аноксия нарушает работу дыхательной цепи клетки. В случае кристаллизации части воды водного раствора глицерина замкнутой сетки не образуется, для клеток есть доступный кислород, а падение скорости реакций может быть связано с увеличением вязкости цитоплазмы.

Рис. 2. Зависимость обратного времени фотовыцветания резонансных линий цитохрома в дрожжевых клетках от температуры. Квадратами показаны данные для клеток в физиологическом растворе, кружками для клеток в водном растворе глицерина. Штриховой линией показана температура образования льда. Результаты получены для интенсивности облучения 2.4 мВт при фокусировки в область ~ 1 мкм².

На температуре 225 К (Рис. 2) происходит резкое замедление скоростей реакции и в случае дрожжевых клеток в глицериновом растворе. Этот эффект связывается с так называемым динамическим переходом для белков, который наблюдается при этих температурах и соответствует «выключению» их функциональных свойств. До настоящего времени влияние эффекта динамического перехода наблюдали только в модельных системах, а наши результаты показали, что это переход может проявляться и в криоконсервируемых биологических клетках.

4. Исследовано поведение колебательных мод ОН-групп в различных фазах сегнетоэлектрика KDP и его дейтерированного аналога DKDP. Измерены спектры КРС этих кристаллов для различных поляризационных условий и при различных температурах, включающих в себя сегнетоэлектрическую и параэлектрическую фазы. Решалась задача определения линий в спектрах КРС, соответствующих колебательных мод ОН-групп. В литературе существуют два варианта ответа для этой задачи. Существует распространенное мнение, что валентное колебание находится в районе 1300-1350 см^-1 и эта интерпретация находится в согласии с эмпирической корреляцией между частотой колебания и расстоянием О-О в кристалле KDP. Другая версия  заключается в том, что моды в районе 2600 и 2400 см^-1 являются валентными колебаниями ОН с водородными связями. Оба варианта ответа согласуются с сопоставлением мод для протонированного и дейтерованного кристаллов KDP. Для решения вопроса об отнесении мод нами было предложено рассмотреть температурную зависимость мод. На рис. 3 показано относительное изменение спектрального положения мод при понижении температуры.

Рис. 3. Относительное изменение линий КРС в кристалле KDP при понижении температуры (относительно значения при комнатной температуре).

Ожидается что частота валентных (растягивающих) колебательных мод ОН групп будет слегка понижаться с понижением температуры, что контрастирует с ожидаемым поведением для валентных мод без водородной связи или деформационных мод ОН групп, позиция которых увеличивается с понижением температуры. Из рис. 3 видно, что поведение мод 1305 и 1793 см^-1 не соответствует предположению о том, что они являются валентными колебаниями ОН с водородными связями. С другой стороны, так как эти моды включают в себя движение ОН-групп (по сравнению со спектрами дейтерированных образцов), то приходим к заключению, что эти моды отражают колебательные моды ОН групп деформационного типа. Поведение мод 2685 и 2375 см^-1 согласуется с предположением, что они являются валентными колебаниями ОН с водородными связями.

5. Изучена фазовая диаграмма криопротектора глицерин-вода в зависимости от протокола охлаждения. Для этих целей водные растворы глицерина различного состава охлаждались с различными скоростями охлаждения, а затем при нагревании измерялась теплоемкость образцов как  функция температуры (дифференциальная сканирующая калориметрия, ДСК). По кривой ДСК были определены температуры стеклования раствора, кристаллизации и плавления. Была построена фазовая диаграмма для значений температуры стеклования для растворов различного состава, изображенная на рис. 4. На этом рисунке синими кружками показаны результаты для температуры стеклования, соответствующие охлаждению и последующему нагреву со скоростью 5 К/мин. Треугольниками показаны результаты для охлаждения с максимальной скоростью, доступной в калориметре (закалка),  и последующего нагрева со скоростью 5 К/мин. Третий режим, результаты которого представлены на рис. 4,  заключался в отжиге закалочных образцов на температуре кристаллизации (согласно кривым ДСК), последующим охлаждением образца на низкую температуру (заведомо ниже температуры стеклования) и последующего измерения кривой ДСК при нагреве со скоростью 5 К/мин. Таким образом определенная температура стеклования показана на рис. 4 красными кружками.

Из рис. 4 видно, что существует две ветви на диаграмме. Горизонтальная (с температурой стеклования около 170 К) соответствует случаю, когда часть воды кристаллизуется, а оставшаяся часть образует стеклующийся водный раствор, который не кристаллизуется даже при длительном отжиге. Из рис. 4 следует, что стеклующийся раствор содержит 75 вес.% глицерина. Вторая ветка на диаграмме рис. 4 соответствует случаю, когда весь исследуемый раствор переходит в состояние стекла. Видно, что существует диапазон составов, который при быстром и/или умеренном охлаждении переходит в метастабильное состояние стекла, которое при последующем нагреве частично кристаллизуется. Нам не удалось застекловать раствор при концентрации глицерина 40 вес% и ниже, в то время как концентрации ниже 30% используются при протоколе витрификации замораживаемых клеток животных (при витрификации препарат закаливают погружением в жидкий азот). Типичное значение концентраций при витрификации и оценочная температура стеклования показано на рис. 4 вертикальным оранжевым отрезком.

Рис. 4. Зависимость температуры стеклования водных растворов глицерина от концентрации.

Из рис. 4 видно, что простая линейная интерполяция между известными температурами стеклования глицерина и воды не дает правильного описания концентрационной зависимости температуры стеклования водных растворов глицерина. В нашей работе мы впервые применили выражение Фокса для предсказания температуры стеклования водных растворов глицерина. Это выражение связывает температуру стеклования бинарного состава    Т¹²_g   с температурой стеклования каждого компонента Tⁱ_g, взвешенной через весовую долю каждого компонента  xⁱ_w :

                                                                                                1/T¹²_g = x¹_w/T¹_g + x²_w/T²_g     

Из рис. 4 видно, что выражение Фокса находится в отличном согласии с экспериментальными результатами.

6. Для анализа состава стеклующейся части водного раствора глицерина была применена спектроскопия КРС. В области СН и ОН валентных колебаний были сравнены спектры КРС 75 вес% раствора глицерина, который, как ожидается, соответствует составу предельной концентрации, который не образует кристаллитов льда при любом протоколе охлаждения и нагрева и соответствует остаточной застеклованной части частично кристаллизованных растворов (Рис. 4) и спектры КРС закристаллизованного 55 вес% раствора глицерина. Было показано, что спектр КРС закристаллизованного 55 вес% раствора глицерина является суммой спектра КРС 75 вес% раствора глицерина и льда. Для демонстрации этого результата на рис. 5 показан спектр 75% раствора (красная линия), 55% раствора (коричневая линия), льда (голубая линия), разницы спектров КРС 55% раствора и льда (синяя линия). Видно, что красная и синяя линия совпадают с высокой точностью.

Рис. 5. Спектры КРС замороженных  водных растворов глицерина и льда в области валентных мод СН и ОН групп.

Таким образом результаты исследования водных растворов глицерина подтверждают вывод   (сделанный из анализа фазовой диаграммы), о том  что в кристаллизованных растворах всегда присутствует застеклованная часть раствора, которая соответствует 75 вес% раствору глицерина.

7. Исследована температурная зависимость ширины линии КРС синтетического алмаза в зависимости от содержания азотной примеси. Показано, что увеличение концентрации азота уширяет линию КРС. Для исследования вопроса о природе дополнительного уширения по сравнению с номинально бездефектным алмазом спектральная форма линии была исследована с высоким спектральным разрешением (0.3 см^-1, FWHM) в широком температурном диапазоне. Было показано, что дополнительное уширение может быть хорошо описано увеличением контура Лоренца.

Рис. 6. Ширина линии КРС бездефектного алмаза (черные кружки) и алмаза, легированного азотом (звездочки) как функция температуры. Линией показано описание температурной зависимости с учетом трех- и четырех-фононного ангармонизма. Пустые кружки – данные для бездефектного алмаза, сдвинутые на 0.85 см^-1.

Сравнение температурной зависимости для ширины линии КРС бездефектного и легированного азотом алмаза приведено на рис. 6. Видно, что легирование азотом не изменяет величины, связанные с ангармонизмом колебательных мод, но приводит к уширению линии за счет статического (независящего от температуры) рассеяния фононов.

8. Исследованы спектры комбинационного рассеяния света многослойных везикул в зависимости от условий синтеза: влияние этапа протокола замораживания-размораживания суспензии с пересечением температуры перехода гель-флюид и длительного низкотемпературного отжига насыщенных липидов (на несколько десятков градусов ниже температуры перехода гель-флюид). Получено, что при отсутствии циклов «замораживания-размораживания» эффективное число бислоев увеличивается в суспензии мембран, но при этом значительная доля материала находится не в сферических липосомах, а образует рваные структуры (согласно наблюдению в оптический микроскоп). Проведение циклов «замораживания-размораживания» (5-6 циклов) приводит к синтезу хорошо определенных липосом, размер которых варьируется от одного до пяти микрон, а оценка числа фосфолипидных слоев находится в диапазоне от несколько десятков до сотни бислоев. Данный результат находится в хорошем соответствии с известными результатами, полученными  методом электронной криомикроскопии. Несмотря на различия в характеристиках наличие или отсутствие циклов «замораживания-размораживания» не приводит к различиям в температурном поведении линий КРС для колебательных мод СС и СН₂ связей и не оказывает влияния на фазовый переход гель-флюид.

9. Изучены спектры комбинационного рассеяния света от серии висмут-фторидных стекол и определены стеклообразующие единицы – цирконатные полиэдры. Скорости звука во фторидных стеклах определены методом рассеяния Мандельштама-Бриллюэна. Также показано, что легирование эрбием приводит к возникновению фотолюминесценции в видимом диапазоне при возбуждении длиной волны 532 нм. Рисунок 7 иллюстрирует возникновение фотолюминесценции при малых рамановских сдвигах в стеклах цирконат-барий-натриевой серии, где использовано одновременное легирование и фторидом висмута и фторидом эрбия.

Рис. 7.