Институт в фотографиях

2018

1. Спектроскопия КРС фосфолипидных мембран тройного состава DPPC-DOPC-холестерин

Разработан и отработан протокол приготовления фосфолипидных мембран тройного состава, образующих водную суспензию многослойных везикул микронного размера. Для контроля локальной концентрации липида и воды в области освещения сфокусированным лазерным лучом был предложен и отработан метод контроля весового отношения липид/вода по характеристикам спектра КРС в области валентных колебательных мод OH и CH2. Нами была продемонстрирована работоспособность этого подхода и экспериментально определен коэффициент пропорциональности (опубликовано  в [1]). Фазовое состояние исследуемых образцов определялось по характеристикам симметричной и антисимметричной мод CH2 в спектре КРС. В процессе выполнения показано, что этот подход может быть применен также и для характеризации конформационного состояния ионных жидкостей на базе ионов, содержащих алкильные цепи (Bmim и Bmmim). Данные по этим материалам опубликованы в [2]. Тройные фосфолипидные мембраны были изучены для составов, показанных кружками на фазовой диаграмме Рис. 1.1. Эти составы покрывают и однофазные состояния и области сосуществования двух и трех фаз (lo – liquid ordered, ld – liquid disordered, g - gel).

2018 ris1 1

Рис.1.1.

 

Пример низкочастотного спектра КРС для DPPC-DOPC состава при низких температурах показан на Рис. 1.2а. На вставке к этому рисунку приведен пример разложения спектра КРС на компоненты, позволяющий определить позицию и ширины пиков. Первый острый пик на этом рисунке соответствует собственному колебанию монослоя (в районе 15 см-1 при температуре 100 К). На Рис. 1.2б показана зависимость позиции этого пика от концентрации холестерина. Видно, что на границах областей сосуществования фаз частота собственных колебаний монослоя испытывает особенности. Значение позиции пика, соответствующего собственным колебательным модам монослоя, различно при различных температурах из-за ангармонических эффектов, которые являются более выраженными при высоких температурах (т.е. анализ колебательных мод удобнее проводить при низких температурах). С другой стороны, вклад мешающей фотолюминесцентной подставки, на которую делается поправка при обработке спектров, существенно ниже при высоких температурах. Поэтому одинаковость влияния холестерина на частоту колебания монослоя, полученного из спектров при различных температурах, подтверждает достоверность результатов. В работе сделан вывод об изменении эффективных упругих констант рассматриваемой тройной системы в областях концентраций, где сосуществуют фазы lo-ld при высоких температурах. Эти области являются предметом дискуссий и большого количества современных исследований, так как считается, что они соответствуют так называемым рафтам в мембранах биологических клеток. Полученный результат позволяет связать образование сосуществующих доменов разных фаз с изменением эффективных упругих констант мембран.

2018 ris1 2a    2018 ris1 2b

Рис. 1.2а                                                  Рис. 1.2б

 

2. Рассеяние Мандельштама–Бриллюэна в суспензиях многослойных фосфолипидных везикул

Для независимого определения упругих констант фосфолипидных мембран в области гигагерцовых частот необходимо развитие спектроскопии рассеяния Мандельштама-Бриллюэна (РМБ). Ранее существовало несколько работ, где упругие константы фосфолипидных слоев определялись в экспериментах с планарными фосфолипидными структурами. Нами  было показано, что можно предложить и реализовать методику измерения бриллюэновских линий для водных суспензий многослойных фосфолипидных везикул и из анализа полученных данных определить эффективную скорость звука в фосфолипидном слое. Для этого были проведены измерения РМБ от большого количества образцов суспензий многослойных фосфолипидных везикул DPPC, в которых варьировалась толщина образцов и концентрация фосфолипида. Анализ спектров РМБ позволил произвести оптимизацию толщины исследуемых образцов. Полученные образцы были довольно тонкими (такими, что вклад в спектры от перерассеянного лазерного луча был достаточно малым, что являлось существенным, поскольку суспензия везикул микронного размера представляет собой сильнорассеивающую среду). В то же время толщина была достаточной для получения приемлемой величины сигнала измеряемого спектра. Оптимум был найден на толщине образца порядка 50 мкм, где искажением спектра на перерассеянном лазерном луче можно пренебречь, так как спектральная форма линий РМБ для такой толщины уже не отличается от спектров РМБ для более тонких образцов. Нами было предложено использовать бифазную модель для анализа полученных данных, где одной фазой является вода, а другой – фосфолипид. Нами показано, что в рамках бифазной модели при условии одинакового механического напряжения скорость звука в  липиде определяется выражением:

2018 f1 1      (1.1)

где ub – эффективная скорость звука суспензии, найденная из позиции пика РМБ, uW – скорость звука в водяной части, найденная из независимого измерения спектра РМБ от образца воды, m - отношение масс фосфолипида и воды в образце и b - отношение плотностей воды и фосфолипида. При условии одинаковой деформации бифазная модель позволяет описать скорость звука липида выражением:

2018 f1 2     (1.2)

Для использования Ур. (1.1) и (1.2) был измерен также образец воды, а для анализа их работоспособности образец сухого фосфолипида, полученного сушкой из суспензии. На Рис. 2.1а показаны спектры РМБ воды, сухих везикул и суспензии при температуре жидкого азота. На Рис. 2.1б показаны температурные зависимости скорости звука водяного образца (1), сухих везикул (2), суспензии (3), результат расчета по Ур. (1.1) – треугольники (4), по Ур. (1.2) – (5) и среднее между ними (6). Видно, что в пределе низких температур расчет по среднему из Ур. (1.1) и (1.2) дает хорошее согласие между РМБ суспензии и сухого образца. Также из Рис. 2.1б видно, что повышение температуры приводит к расхождению между скоростями звука сухих везикул и суспензии везикул из-за различия в их динамике (фазовый переход гель-флюид находится на 41 °С для везикул DPPC в суспензии и на 106 °С для сухого DPPC). Таким образом, создана методика, позволяющая определять скорость звука в фосфолипидных слоях  из спектров РМБ суспензий при их полной гидратации.

2018 ris2 1a     2018 ris2 1b

Рис. 2.1а                                                                                                    Рис. 2.1б

Определенная скорость звука (2,95 км/с) и плотность липидных слоев (1,05 г/см3) позволили рассчитать продольный модуль упругости липидного слоя в пределе низких температур – 9.1 ГПа.

В 2018 году в журналах были опубликованы статьи по экспериментальным результатам, полученным в предыдущие годы выполнения проекта. Статья [3] посвящена исследованию сегментальной динамики полистиролов и поливинилпиридинов с различным молекулярным весом, где объясняется особенность зависимости индекса фрагильности от молекулярного веса для этих стеклующихся полимеров. Статья [4] посвящена изучению структурных свойств этанола и глицерина  (стеклующихся жидкостей с водородными связями)  по характеристикам спектров КРС в области полосы валентных колебательных мод связей ОН.

3. Фазовые переходы во внутриклеточных липидных гранулах замораживаемых эмбрионов и ооцитов домашней кошки

В настоящее время криоконсервация эмбрионов и ооцитов активно используется в репродуктивной медицине, а также для сохранения линий лабораторных и сельскохозяйственных животных. Применяемые протоколы криоконсервации позволяют справиться с проблемами, вызываемыми кристаллизацией воды, однако, по-видимому, именно фазовые переходы липидов, происходящие в липидных гранулах и мембранных структурах клетки, ответственны за трудности, возникающие при криоконсервации ооцитов и эмбрионов «проблемных» видов животных, к которым относят кошачьих. Считается, что повреждающие факторы протоколов криоконсервации связаны с фазовыми переходами, возникающими при охлаждении. Для разработки новых эффективных протоколов необходимо изучать эти фазовые переходы непосредственно в замораживаемых клетках, то есть бесконтактным и неинвазивным методом с высоким пространственным разрешением. В рамках настоящего проекта фазовые переходы во внутриклеточных липидных гранулах замораживаемых эмбрионов и ооцитов домашней кошки  были изучены методом спектроскопии КРС. Для этой цели нашей группой впервые в мире был разработан и реализован протокол измерения этих половых клеток.

2018 ris3 1

Рис. 3.1

Работа велась в сотрудничестве с Сектором криоконсервации (рук. С. Я. Амстиславский) ИЦиГ СО РАН. Эмбрионы и ооциты подготавливались в ИЦиГ СО РАН, переносились в ячейку для измерения спектров КРС под микроскопным объективом, куда добавлялась необходимая концентрация криопротектора (глицерин) и далее эмбрион охлаждался по протоколу «программного замораживания» до температуры, при которой проводилось измерение КРС.

На Рис. 3.1 показаны спектры КРС от незрелых ооцитов (СОС, фото на вставке (a)), зрелых ооцитов (OOcyte, фото на вставке (b)) и эмбрионов (Embryo, фото на вставке (с)) домашней кошки при комнатной температуре Спектры включают в себя диапазон валентных CH2 колебаний (2800-3100 см-1), C=O колебаний (~1750 см-1), C-C колебаний (1000-1200 см-1) и другие линии. Для эмбриона на Рис 3.1 показаны также спектры КРС при нескольких характерных температурах (фото на вставке (d) показывает эмбрион при -50 °С, а (e) – это увеличенная область, где можно хорошо видеть липидные гранулы).

По температурным изменениям спектров КРС можно делать выводы о состоянии молекул (триглицеридов) в липидных каплях эмбриона. Для примера на Рис. 3.2 показана часть спектра в области валентных CH2 колебаний. Из отношения интенсивностей КРС антисимметричной (~2880 см-1) и симметричной (~2850 см-1) колебательных мод можно  делать выводы о степени латериального и конформационного порядка. Это отношение выше для случая упорядоченного состояния. На вставке Рис. 3.2 показана температурная зависимость этого отношения для эмбриона кошки (черные кружки), которая позволяет определить температуру липидного фазового перехода в районе -5 °С.

2018 ris3 2 

Рис. 3.2

Для сравнения здесь же показано отношение для ненасыщенного фосфолипида DOPC, фазовый переход гель-флюид которого является хорошо изученным. Выбор именно этого липида для сравнения связан с тем, что в DOPC число ненасыщенных связей (1 на углеводородную цепь) близко к значению, полученному нами из анализа спектров КРС для липидных гранул эмбрионов и ооцитов. Видно хорошее соответствие температурного поведения модельного фосфолипида и липидных гранул эмбриона.

Из анализа спектров КРС нами были сделаны следующие выводы (опубликовано в [5]):

- Отношение интенсивностей пиков антисимметричного и симметричного СН2 колебаний является высокочувствительным индикатором фазового перехода, позволяющим определять температуры фазовых переходов в случае клеток с низким содержанием липидов. Также для исследования фазовых переходов в клетках может быть    использован диапазон С-С колебаний, в частности “all-trans” мода на ~1130 см−1.

- Изменение характеристик линии С=O группы позволяет получать информацию о кристаллизации (трансляционном упорядочении) липидов. Было обнаружено, что для разных стадий развития ооцитов кристаллизация липидов может протекать по-разному. В случае ранних стадий развития наблюдается резкий переход в состояние с трансляционным упорядочением, в то время как для более поздних стадий этот переход размыт.

- Упорядочение конформационных и трансляционных степеней свободы может происходить на разных этапах замораживания. При этом наблюдается промежуточное состояние с порядком по конформационным состояниям и беспорядком по трансляционным состояниям.

Разработанный подход открывает новые возможности для отслеживания фазовых переходов липидов в одиночных эмбрионах и ооцитах. В перспективе примененный метод КРС к исследованию замораживаемых биологических клеток может быть использован для изучения возможных неоднородностей фазового состояния липидов в замораживаемых клетках.

В 2018 году по результатам исследования эффекта фотовыцветания резонансных линий цитохрома в спектре КРС при замораживании дрожжевых клеток, полученным в предыдущие годы выполнения проекта, была опубликована статья [6].

По результатам работ в 2018 году  можно констатировать:

Метод низкочастотного КРС адаптирован и успешно применен для исследования фосфолипидных мембран тройного состава DPPC-DOPC-холестерин. При различных температурах были определены параметры пика КРС, отвечающего за собственные колебания фосфолипидного монослоя, как функции содержания холестерина для тройного состава DPPC-DOPC-холестерин. Сделан вывод об изменении эффективных упругих констант рассматриваемой тройной системы в областях концентраций, где сосуществуют фазы lo-ld при высоких температурах.

С использованием спектроскопии КРС определены температуры полиморфных фазовых переходов во внутриклеточных липидных гранулах замораживаемых эмбрионов и ооцитов домашней кошки. Показано, что разработанный подход позволяет детально характеризовать фазовые переходы липидов в одиночных эмбрионах и ооцитах в процессе криоконсервации. Впервые в мире показано, что для разных стадий развития ооцитов кристаллизация липидов в липидных гранулах может протекать по-разному. В случае ранних стадий развития наблюдается резкий переход в состояние с трансляционным упорядочением, в то время как для более поздних стадий этот переход размыт.

Разработан и реализован подход в спектроскопии рассеяния Мандельштама-Бриллюэна, позволяющий исследовать суспензии многослойных фосфолипидных везикул и определять скорость звука в фосфолипидных слоях. Получена температурная зависимость этой скорости звука при низких температурах и сделана оценка модуля упругости фосфолипидных слоев.

4. Исследование кристаллов и композитов методами колебательной спектроскопии

Известно, что при появлении химического беспорядка сегнетоэлектрические кристаллы приобретают свойства сегнетоэлектриков с уширенным фазовым переходом (релаксоров). Появление релаксорных свойств тесно связано с полярными локальными областями, возникающими в параэлектрической фазе кристалла. Взаимодействие этих локальных полярных областей с акустическими волнами приводит к аномальному температурному поведению упругих постоянных в окрестности сегнетоэлектрического фазового перехода. Поэтому из температурных  зависимостей акустических аномалий можно  определить свойства локальных полярных областей в параэлектрической фазе сегнетоэлектриков.

Для сравнения акустических аномалий в сегнетоэлектриках и релаксорах в 2018 году в рамках проекта исследованы кристаллы ниобата бария стронция SrxBa1-xNb2O6 (SBN-x) различного химического состава (x = 0.3, 0.5, 0.6, 0.75). Известно, что при x = 0.3, 0.5 эти кристаллы проявляют свойства «обычных» сегнетоэлектриков, а при x = 0.6, 0.75 – свойства релаксоров. Кристаллы SBN-x были выращены методом Степанова в ИОФАН. Образцы для  проведения экспериментов были изготовлены в виде полированных параллелепипедов, вырезанных вдоль кристаллографических осей. Измерялись спектры рассеяния Мандельштама – Бриллюэна на шестипроходном интерферометре Фабри – Перо. Сегнетоэлектрические фазовые переходы в образцах с различной степенью химического беспорядка были исследованы также с помощью методик дифференциальной сканирующей калориметрии и диэлектрической спектроскопии.

Типичные спектры рассеяния Мандельштама – Бриллюэна в геометриях рассеяния    Ζ(ХХ)Z и X(ZZ)X, обозначенные цифрами 1 и 2, приведены на Рис. 4.1 (кристалл SBN-0.6). В геометрии X(ZZ)X, где поляризация падающего и рассеянного света параллельна оси Z, отчетливо проявляется центральный пик, обусловленный релаксационными откликом параметра порядка. В случае, когда поляризация света перпендикулярна Z, центральный пик отсутствует.

На Рис. 4.2 приведены температурные зависимости положения и ширины максимума (FWHM) пиков Мандельштама - Бриллюэна в кристаллах SBN-x в геометриях рассеяния ΖХХ)(Z и X(ZZ)X , в которых, согласно правилам отбора, допускается только продольная акустическая мода (LA). Пунктирные линии представляют линейные температурные зависимости положения линии Мандельштама - Бриллюэна в высокотемпературном приближении, а вертикальные пунктирные линии представляют собой температуру сегнетоэлектрического фазового перехода Tm, определенную независимо из измерений восприимчивости, пироэлектрического отклика и генерации оптической второй гармоники.  FWHM пика Мандельштама - Бриллюэна определяли подгонкой функцией Фойгта.

2018 ris4 1

Рис. 4.1

Из данных, приведенных на Рис. 4.2  следует, что в случае, когда вектор акустической волны перпендикулярен оси Z, скорости звука (и величины упругих модулей) нечувствительны к фазовому переходу для всех исследованных кристаллов. Внутри всего рассмотренного температурного интервала они демонстрируют линейные температурные зависимости, а ширина линий практически не зависит от температуры.  При этом для акустических волн вдоль оси Z (геометрия Z(XX)Z) наблюдаются аномалии ширины линии и упругого модуля в окрестности фазового перехода.

2018 ris4 2

Рис. 4.2 Температурные зависимости положения пика Мандельштама - Бриллюэна и его ширины в кристаллах SrxBa1- xNb2O6  Звездочки и пустые треугольники соответствуют геометрии X(ZZ)X. Красные и синие данные соответствуют смещению пика для режимов ZFH и ZFC в геометрии Z(XX)Z. Черные треугольники соответствуют FWHM в геометрии Z(XX)Z. Зеленые пунктирные линии представляют линейные температурные зависимости положения линии Мандельштама - Бриллюэна в высокотемпературном приближении, а вертикальные пунктирные линии - температуры сегнетоэлектрического фазового перехода Tm.

 

Ранее было предложено описывать аномалии упругого модуля С33 в параэлектрической фазе в рамках модели, согласно которой дипольный момент полярных областей влияет на модуль упругости через электрострикцию. Нами было показано, что эта модель не позволяет описать экспериментальные данные. Тем не менее, из полученных экспериментальных данных было установлено модельно независимое эмпирическое описание аномалий акустических свойств, которые отражают влияние полярных локальных областей на акустические свойства в сегнетоэлектриках и релаксаторах. Показано, что акустические аномалии проявляются по-разному в зависимости от величины x, которая отражает дефектность кристаллов из-за химического беспорядка (смотр., например, на величины отклонения от линейного поведения для разных кристаллов на Рис. 4.2).

2018 ris4 3

Рис. 4.3

Зависимость сегнетоэлектрического фазового переходы в SBN-x от степени химического беспорядка (x) была исследована методами дифференциальной сканирующей калориметрии. Показано, что изменения теплоемкости при фазовом переходе достаточно легко детектируются лишь для кристаллов SBN-x, которые традиционно относят к типу «обычных» сегнетоэлектриков (x = 0.3, 0.5), как показано на Рис. 4.3. В кристаллах SBN-x, относящихся к релаксорам (x = 0.6, 0.75), изменения теплоемкости сильно размыты, и отличить их от общего фона проблематично. Тем не менее, этот фазовый переход отчетливо проявляется в экспериментах по генерации второй оптической гармоники, диэлектрической спектроскопии, и по аномалиям акустических свойств. Подобное различие в проявлении сегнетоэлектрического фазового перехода в релаксорах в настоящее время неясно и является предметом будущих исследований.

В 2018 году в журналах были опубликованы статьи по экспериментальным результатам, полученным в предыдущие годы выполнения проекта: Статья [7] посвящена исследованию нелинейно-оптического отклика серии кристаллов SBN-x и его связи с особенностью сегнетоэлектрического фазового перехода в кристаллах этой серии. Статья [8] посвящена сегнетоэлектрическим кристаллам KDP и DKDP и интерпретации спектра КРС этих материалов с целью описания валентных колебательных мод OH и OD групп.

По результатам работ в 2018 году  можно утверждать:

Исследованы температурные зависимости диэлектрической проницаемости, теплоемкости и спектров рассеяния Мандельштама – Бриллюэна в серии кристаллов SBN - x, относящихся как к обычным сегнетоэлектрикам (x = 0.50, 0.33), так и к релаксорам (x = 0.75, 0.61). Показано, что только для акустических волн, распространяющихся вдоль полярной оси, в определенном температурном диапазоне в окрестности фазового перехода наблюдаются как аномалии модуля упругости, так и уширение линии Мандельштама – Бриллюэна, характеризующее увеличение затухания продольных акустических волн. Эти аномалии наиболее выражены в кристаллах с большим химическим беспорядком. Продольные звуковые волны, распространяющиеся вдоль оси Z, имеют более медленную скорость и большее затухание, чем аналогичные волны, распространяющиеся поперек Z. В рамках модели, где аномалии акустических свойств кристалла определяются взаимодействием акустических волн с локальными диполями, локальные полярные области в параэлектрической фазе сильно анизотропны.